烷基酚檢測(cè)試劑盒 貨號(hào)：PN 590012

（請(qǐng)以英文為準(zhǔn)，中文僅供參考）

試劑盒特點(diǎn) 

1.AP單克隆抗體特異地與AP結(jié)合，和其它結(jié)構(gòu)相類(lèi)似的化學(xué)物質(zhì)不發(fā)生交叉反應(yīng)。單克隆抗體質(zhì)量穩(wěn)定每批次見(jiàn)幾乎沒(méi)有變化。

2.檢測(cè)范圍5μg/L - 500μg/L (ppb) 。通過(guò)固相萃取濃縮可以檢測(cè)更低的濃度。

3.這個(gè)試劑盒有很高的重復(fù)性，變異系數(shù)在10%之內(nèi)。

4.操作簡(jiǎn)單，整個(gè)過(guò)程僅花費(fèi)2.5小時(shí)

5.試劑盒的形式是96孔微孔板，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，花費(fèi)合理。

烷基酚檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理 （競(jìng)爭(zhēng)ELISA）

1. 競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng) 

這個(gè)檢測(cè)方法依靠單克隆抗體來(lái)識(shí)別AP。樣品中的AP和一個(gè)AP-酶結(jié)合物預(yù)先混合然后加入到每個(gè)微孔中競(jìng)爭(zhēng)包被在微孔表面的特異性抗體。樣品中AP的濃度如果高于AP-酶結(jié)合物，AP將主要與抗體結(jié)合。反之樣品中AP的濃度如果低于于AP-酶結(jié)合物，AP-酶結(jié)合物將主要與抗體結(jié)合。

2. 顯色反應(yīng) 

通過(guò)洗滌步驟去除沒(méi)有反應(yīng)的AP和過(guò)多的AP-酶結(jié)合物。通過(guò)加入底物來(lái)檢測(cè)AP。和微孔板中抗體結(jié)合的AP-酶結(jié)合物催化底物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)。通過(guò)一個(gè)孵育期用稀酸終止反應(yīng)。樣品中AP的濃度越高導(dǎo)致結(jié)合到微孔板抗體上的AP-酶結(jié)合物越少，從而產(chǎn)生的顏色越淡，吸光度越低。

3. 定量分析 

利用已知濃度的AP標(biāo)準(zhǔn)的濃度和在450nm條件下獲得的吸光度值做出一條劑量反應(yīng)曲線（標(biāo)準(zhǔn)曲線）。把樣品的吸光度值用內(nèi)插法插入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中可以精確的計(jì)算出樣品中AP的濃度。

AP 檢測(cè)流程

烷基酚檢測(cè)試劑盒1.樣品處理

在操作前半小時(shí)從冰箱中拿出試劑盒使其恢復(fù)到室溫（18-25°C）。過(guò)濾樣品，加入甲醇和DMSO使甲醇的最終濃度為10% (v/v),DMSO的最終濃度為1%(v/v)。對(duì)于一些樣品進(jìn)行固相萃取是必要的。

2. 標(biāo)準(zhǔn)溶液

利用甲醇溶液（甲醇：水 0.8：8.2）把AP標(biāo)準(zhǔn)濃縮液稀釋10倍。然后對(duì)此溶液進(jìn)一步稀釋成設(shè)定的AP標(biāo)準(zhǔn)的濃度（5μg/L- 500μg/L）。在配制的時(shí)候先加甲醇溶液后加標(biāo)準(zhǔn)。

3. 抗原-酶結(jié)合物溶液

重新配制一瓶抗原-酶結(jié)合物溶液：抗原-酶結(jié)合物粉末(#3) + 緩沖液(#4, 白蓋).

4. 標(biāo)準(zhǔn)/樣品 與結(jié)合物混合

在沒(méi)有包被的微孔板中(#8)混合100μL AP標(biāo)準(zhǔn)（或樣品）和100μL酶結(jié)合物溶液。先加結(jié)合物后加標(biāo)準(zhǔn)或樣品。

5. 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)

在包被抗體的微孔板(#1)的每個(gè)孔中加入100μL在第四步中混合的溶液，在室溫(18-25°C)孵育60分鐘。

6. 洗液

用蒸餾水以1：5的比例稀釋洗液（6倍濃縮）：1ml 洗液(#5) + 5ml蒸餾水

7. 沒(méi)有結(jié)合的物質(zhì)

每個(gè)微孔用300μL的洗液沖洗，并重復(fù)兩次。在吸水紙上用力的排板出去微孔中的液體。

8. 顯色

每個(gè)微孔加入100μL顯色試劑(#6, 棕色瓶)，在室溫(18-25°C)孵育30分鐘。然后加入每孔再100μL的終止液(#7, 黑蓋)終止反應(yīng)。

10. 定量

在450nm測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用內(nèi)插法把樣品的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中AP的含量。

烷基酚檢測(cè)試劑盒所需材料

必需 – 樣品濃縮時(shí)不需要

1.一次性玻璃試管(e.g. IWAKI, item No. 9831-1207)確保要使用一次性試管避免AP的吸附作用

2.玻璃纖維濾器(e.g. ADVANTEC Co., item No. 36481047 Φ47mm)和過(guò)濾設(shè)備

3.微量加液器(20μL - 200μL 和100μL - 1000μL, e.g. Gilson Pipetman P-200, P-1000)和吸頭

(e.g. ICN Superpack 96NS)

4.排槍(50μL - 300μL)

5.酶標(biāo)儀（450nm波長(zhǎng)）(e.g. TECAN Sunrise Remote)

6.計(jì)時(shí)器

7.Strip ejector (e.g. COSTAR, No.2578)

8.甲醇Methanol (HPLC grade)

9.DMSO(HPLC grade)

2）必需- 通過(guò)SPE 濃縮時(shí)需要

n 以上的材料都需要,再加上下面的材料

n 固體萃取柱(e.g. NEXUS SPE Cartridge Producer: VARIAN PART#:1210-3102 ABS ELUT- NEXUS, 200MG 6ML,30/PK)

n 丙酮(HPLC grade)

n 二氯甲烷(analytical reagent)

3、重要性

如果在試驗(yàn)過(guò)程中使用一些沒(méi)有使用過(guò)的廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品試劑時(shí)需要做比較試驗(yàn)。 

檢測(cè)步驟

烷基酚檢測(cè)試劑盒重要性 

1.僅用于研究、不用于個(gè)人 

2.在操作前半小時(shí)從冰箱中拿出試劑盒使其恢復(fù)到室溫（18-25°C）。

3.不同試劑盒的中的試劑不要混用

4.儲(chǔ)存在2-8 °C

5.不使用過(guò)期產(chǎn)品

6.使用完試劑盒后根據(jù)當(dāng)?shù)氐姆ㄒ?guī)處理廢液。

7.為了增加準(zhǔn)確性推薦在檢測(cè)中做兩個(gè)重復(fù)。

注意

在試驗(yàn)中要穿保護(hù)性衣服，戴手套和眼鏡保證和試劑盒中的液體接觸。

1．樣品前處理

利用特定的玻璃纖維濾紙(1μm 孔徑)過(guò)濾水樣，加入DMSO和甲醇使DMSO終濃度為1% (v/v)、甲醇終濃度

為10% (v/v)。如果濾液要求濃縮和清洗需要固相萃取。

例子

1）將上面制備濾液過(guò)NEXUS cartridge柱（已經(jīng)用二氯甲烷(ex. 10ml)、甲醇(ex. 5ml)、蒸餾水(ex. 5ml)提前處理好的），流速10mL/min

2）用蒸餾水(ex. 5ml)和50%蒸餾水/甲醇(ex. 5ml)洗柱。真空干燥柱不超過(guò)45分鐘。

3）用二氯甲烷(ex. 6ml)洗脫分析物、然后用氮?dú)猓ㄔ?0攝氏度或更低的溫度）吹干。

4）加入甲醇和DMSO溶液溶解殘留物，調(diào)節(jié)溶液的終濃度到1%DMSO和10%甲醇溶液。

2.  標(biāo)準(zhǔn)溶液

制備甲醇溶液（甲醇：蒸餾水=0.8 ml/8.2ml）以備稀釋標(biāo)準(zhǔn)(#2, 10% v/v DMSO, 20% v/v

methanol)使用。利用上面制備的甲醇溶液以1：9的比例稀釋AP標(biāo)準(zhǔn)(#2)來(lái)配制設(shè)定的AP標(biāo)準(zhǔn)溶液(1% v/v DMSO, 10% v/v methanol)。

1）在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的過(guò)程中先加甲醇溶液后加標(biāo)準(zhǔn)(#2)。這樣可以減少AP對(duì)試管壁的吸附。

2）推薦使用一次性玻璃試管來(lái)稀釋標(biāo)準(zhǔn)，可以減少吸附和污染。

3）如果不經(jīng)過(guò)10倍稀釋儲(chǔ)存液的步驟直接稀釋到設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，那么標(biāo)準(zhǔn)的真實(shí)濃度將要比計(jì)劃的濃度要大，所測(cè)定的吸光度的值要小0.2-0.5。確保要先稀釋10倍。

4） 在測(cè)定前制備AP標(biāo)準(zhǔn)溶液，一旦標(biāo)準(zhǔn)溶液從濃縮的狀態(tài)稀釋后就不再穩(wěn)定了，不易保存很長(zhǎng)時(shí)間。每個(gè)檢測(cè)過(guò)程都要配制新的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

5） 用移液器吸頭混勻，不要渦旋震蕩器用劇烈震蕩來(lái)減少樣品中AP對(duì)試管壁表面的吸附。

6） 在使用完之后要確保標(biāo)準(zhǔn)濃縮液的蓋擰緊并放在冰箱，標(biāo)準(zhǔn)溶液必須被密封或把蓋擰緊以免甲醇揮

發(fā)。

7）保證標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醇的濃度為10%。過(guò)高的甲醇濃度可以損害抗體，太低的濃度導(dǎo)致結(jié)果讀數(shù)不正確。

8）不要隨意處理試驗(yàn)廢液，要按當(dāng)?shù)氐姆ㄒ?guī)來(lái)處理。

3. 抗原-酶結(jié)合物

重新配制一瓶抗原-酶結(jié)合物溶液：抗原-酶結(jié)合物粉末(#3) + 7ml緩沖液(#4, 白蓋)。

1.配制好的溶液要儲(chǔ)存在2-8°C，可以穩(wěn)定地保存2周。

2.  7mL足夠50個(gè)孔使用。

3.         用移液器吸頭混勻，轉(zhuǎn)移液體時(shí)不要產(chǎn)生氣泡。

4.在使用的時(shí)候配制。

4. 標(biāo)準(zhǔn)/樣品 與結(jié)合物混合

在沒(méi)有包被抗體的微孔板中(#8)加入100ul酶結(jié)合物溶液，然后再加入100ul在第二步中配制的AP標(biāo)準(zhǔn)溶液或100μL樣品（制備的1% (v/v) DMSO 和10 % (v/v) 的甲醇溶液）。用移液器吸頭混勻。

1.首先加入結(jié)合物溶液然后加入標(biāo)準(zhǔn)或樣品避免孔的內(nèi)表面的非特異性吸附。

2.用移液器吸頭混勻，轉(zhuǎn)移液體時(shí)不要產(chǎn)生氣泡。

3.用1% DMSO 和10%的甲醇溶液做一個(gè)空白。

5. 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng) 

在包被抗體的微孔板(#1)的每個(gè)孔中加入100μL在第四步中混合的溶液，輕輕是震蕩微孔板使其內(nèi)部的液體混勻，在室溫(18-25°C)孵育60分鐘。

1.包被抗體的酶標(biāo)板共有12條，每條有8個(gè)孔，在檢測(cè)前取出所需的孔。然后把不用的再重新放好。

2.在轉(zhuǎn)移液體時(shí)要確保不產(chǎn)生氣泡，因此操作要輕。

3.用膠帶覆蓋微孔板避免污染和液體揮發(fā)。

4.在反應(yīng)期間不要移動(dòng)和振動(dòng)微孔

5.溫度控制在18-30°C

6.嚴(yán)格反應(yīng)時(shí)間

6. 洗液 

用蒸餾水以1：5的比例稀釋洗液（6倍濃縮）(#5)：20ml 洗液(#5) + 100ml蒸餾水 。每次檢測(cè)配制所需體積的溶液，每個(gè)孔每次要求1.2mL的洗液，整個(gè)板需要120 mL。洗液要保存在2-8°C，在配制后大約可以穩(wěn)定保持一個(gè)月的時(shí)間。

7. 沒(méi)有結(jié)合的試劑 

每個(gè)微孔用300μL的洗液沖洗，并多重復(fù)兩次。在吸水紙上用力的拍板除去微孔中的液體。

1.要確保除去任何遺留液體，否則可能引起測(cè)量錯(cuò)誤。

2.確保微孔板底部干凈，不要有手印或其它污垢，否則吸光度將有很大改變。

3.不要傾倒任何沒(méi)有處理的廢液，例如：浸泡的布或紙要燃燒掉。

8. 顯色反應(yīng)

在每個(gè)微孔中加入100ul顯色液(#6, brown vessel)。在室溫下孵育30min。然后每個(gè)微孔加入100ul終止液(#7,黑蓋)終止反應(yīng)。

1.孵育溫度控制在18-30°C

2.要使每個(gè)孔的反應(yīng)時(shí)間一致，尤其在測(cè)試多個(gè)樣品的時(shí)候

3.加入終止液后孔中的藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 

9. 定量 

在450nm用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品的吸光度值。

1.在終止反應(yīng)15分鐘內(nèi)測(cè)定吸光度值。

2.每次檢測(cè)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)至少做兩個(gè)重復(fù)。

3.確保微孔底面沒(méi)有手印和污物，否則測(cè)定的吸光度值有很大的改變。

4.樣品的檢測(cè)范圍5μg/L - 500μg/L，樣品中AP的濃度超過(guò)500μg/L時(shí)要用10%甲醇+1% DMSO稀釋后再測(cè)定。對(duì)于完全不知情的樣品做前處理時(shí)要做遠(yuǎn)不止一倍的稀釋。

計(jì)算樣品中AP濃度的方法

（1）電腦計(jì)算

利用酶標(biāo)儀分析軟件，用Log-Log (or Log-Linear)曲線。

（2）利用附帶的曲線圖計(jì)算

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